聚合酶链式反应（PCR）引物序列的选择
发布时间:2023-03-22为了选择用于PCR的引物，必须知道目标的序列，应避免多态序列。PCR产物的长度与扩增的效率成反比[1]。此外，较短的目标物更有可能在标本运输和处理过程中保持完整，从而使检测更稳定。PCR扩增子的最佳大小为100至300个碱基对（bp）。尽管选择成功的引物可能有些经验主义，但下面是一些常用的准则：
➤ 使用与扩增产物相同的鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）含量（最好是50%）；
➤ 避免引物中的二级结构，特别是在3′端；
➤ 使用相互之间不互补的引物；
➤ 使用长度在20到30个碱基之间的引物（或更长）。
额外的设计标准用于为使用荧光5′核酸酶化学的实时PCR测定设计的引物。这包括以下内容：
➤ 在选择检测探针后选择引物；
➤ 设计引物，使其接近探针而不与之重叠；
➤ 保持G+C含量在30 ~ 80%之间；
➤ 避免运行相同的核苷酸；也应避免运行四个或更多的G碱基；
➤ 熔解温度（Tm）为58至70℃；
➤ 3′端的五个核苷酸应不超过两个G和/或C碱基。
一些商业化的以及公开的引物设计软件包可用于帮助引物设计。然而，使用这些准则和软件包并不能保证成功。在实践中，通常会合成几个满足上述标准的引物对，并进行测试以找到最佳引物对。
参考文献
[1] Toouli CD, Turner DR, Grist SA, Morley AA. The effect of cycle number and target size on polymerase chain reaction amplification of polymorphic repetitive sequences. Anal Biochem. 2000;280(2):324-326.
