Western实验步骤

WB实验，是一种常用的蛋白分析技术。实验中每一步的把握，将会直接影响结果的显现。本文将给大家展示WB实验的详细操作步骤。
 
简介
WB，蛋白质印迹（Western blotting）又称免疫印迹（immunoblotting）,是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白的方法，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
 
实验原理
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
 
实验步骤：
 
一、蛋白样品的提取及蛋白含量的检测
 
蛋白样品的好坏，直接决定了能否做出来蛋白条带，所以蛋白样品的提取需严格按照试剂盒说明书进行。
 
二、凝胶配制
凝胶选择：请根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书，或者参考文献。配胶的APS需要在4° 的冰箱中保存。注意，配胶的时候，胶一定一定要混匀。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。
 

分离胶浓度    最佳分离范围    

6%    50-150kDa    

8%    30-90kDa    

10%    20-80kDa    

12%    12-60kDa    

15%    10-40kDa    

 
操作：将配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中，这个时候不用担心打入气泡。灌入合适量的分离胶之后，加入适当剂量的ddWater或者无水乙醇封胶。（加入封胶试剂量没有规定，盖住整个分离胶胶面即可）。
 
三、上样
Marker孔加入5-10μL，其余蛋白总上样量30-50μg。
 
四、电泳
接上电源后，先用80V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5h。
 
小贴士：根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。电泳开始的时候，开制冰机制冰，为后面的转膜做准备。
 
五、转膜（湿转）
 
操作步骤
1. 取出凝胶，根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，并裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，滤纸应与纤维垫相同大小；
2.PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；
3. 按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入湿转电转槽内，黑色板的一面对黑色负极；
4.在转膜槽中加满电转液，开始转膜。（转膜槽置于水中，并放入冰冻结块的冰袋，尽量多放几个冰袋，保证电转一直处于低温下进行。若转膜时间较长，中途温度升高，可更换冰袋）。
 

蛋白大小/kDa    电流/mA    时间/min    

＜10    150    30    

10-20    150    50    

20-30    150    70    

30-45    150    90    

45-70    150    120    

80-100    200    120    

100-140    200    150    

 
小贴士：蛋白大小大于140kDa条件下，先在电流200mA情况下转膜120min，然后将电流提高到250mA，继续转膜30min。

漂洗
PVDF膜置于回旋振荡器上漂洗1min，重复漂洗2-3次。

六、封闭
用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。磷酸化蛋白用5%的BSA封闭2h。

七、一抗孵育

用含5%脱脂奶粉的TBST（检测磷酸化蛋白用含5% BSA的TBST）稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。

洗涤
TBST充分洗涤PVDF膜3次，15min/次。

八、二抗孵育
用稀释一抗体系相同的稀释液稀释HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温孵育1h。

洗涤
TBST充分洗涤PVDF膜4次，15min/次。

九、显色曝光
ECL发光液A液与B液1：1混合（现配现用）；
PVDF膜从TBST洗液中取出后，用滤纸吸干水分（一般用干净镊子夹住PVDF膜，让膜的一角接触滤纸）；
将PVDF放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。

小贴士：先选择自动曝光进行曝光。同一张膜上未曝光出条带的，可选择手动曝光，加长时间再次曝光。